Phân tích nước

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMINE E TRONG DẦU THỰC THỰC VẬT

1.1 GIỚI THIỆU VỀ DẦU THỰC VẬT

1.1.1 Giới thiệu chung về dầu thực vật

Dầu thực vật là loại dầu được chiết xuất, chưng cất và tinh chế từ thực vật (một số bộ phận thường được sử dụng để chiết xuất dầu như: hạt, lá, củ, quả). Hiện nay dầu thực vật thường tồn tại ở hai dạng đó là: dầu chưa tinh chế (nguyên bản) và dầu tinh chế (Gupta 2017).

Dầu ăn tinh chế thường được sản xuất công nghiệp với quy mô lớn. Dầu thô sau khi ép được trải qua quá trình tinh luyện sử dụng dung môi và các phản ứng hóa học để tách lọc dầu. Dầu sẽ thất thoát khá nhiều độ béo và hàm lượng vitamin E và A, dưỡng chất vì sử dụng nhiệt, hóa chất, và các phản ứng hóa học dể tách dầu, tuy rằng hàm lượng acid béo omega-3 không thay đổi (Gupta 2017).

Dầu ăn chưa tinh chế hay còn gọi là dầu ăn nguyên chất là loại được ép cơ học và là nước dầu thô đầu tiên, giữ được độ béo và hàm lượng vitamin E và A có trong nguyên liệu, tuy nhiên trong dầu nguyên chất này sẽ còn lẫn một số tạp chất (Gupta 2017).

1.1.2 Phân loại một số dầu thực vật thông dụng.

1.1.2.1 Dầu đậu nành.

Dầu đậu nành được chiết xuất từ hạt đậu nành. Dầu tinh khiết có màu vàng sáng, thành phần acid béo chủ yếu là acid lioleic (50.8%), oleic (22.8%). Dầu nầu nành được sử dụng nhiều trong thực phẩm. Nó được làm chủ yếu dầu gán và dầu ăn (John, Bhattacharya, and Turner 2002).

1.1.2.2 Dầu dừa

Dầu dừa được chiết từ cơm dừa, có chứa các acid béo no, acid lauric (46%), myristic (17%), panmitic (9%). Hàm lượng các acid béo không no trong dầu dừa rất ít. Dầu dừa được sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, sản xuất margarine và là nguyên liệu tốt đẻ sản xuất xà phòng và biodiezel (Boemeke et al. 2015).

1.1.2.3 Dầu bông

Dầu bông có màu sắc rất đặc biệt: màu đen hoặc màu sẫm. Dầu bông có sắc tố carotenoit và đặc biệt là gossypol. Gossypol là một độc tố mạnh nên muốn chuyển dầu bông thành dầu thực phẩm phải tách gossypol ra bằng phương pháp tinh chế dùng kiềm hay acid anthranilic. Trong dầu bông có chứa nhiều acid béo no panmitic nên ở nhiệt độ phòng nó ở thể rắn. Bằng cách làm lạnh dầu người ta tách acid palmitric ra để dùng dể sản xuất margarine và xà phòng (Chen et al. 2021).

1.1.2.4 Dầu cọ

Từ cây cọ có thể sản xuất ra được dầu nhân cọ và dầu cùi cọ. Đây là 2 loại khác nhau và cũng có những ứng dụng khác nhau. Dầu cùi cọ chứa nhiều caroten nên được đụng để sản xuất tiền chất của vitamin A . Dầu nhân cọ dùng để sản xuất bánh kẹo. Cả hai loại này có thể dùng nấu xà phòng hay để tổng hợp biodiezel (Lai, Tan, and Akoh 2015)

1.1.2.5 Dầu hướng dương

Dầu hướng dương là loại dầu được chiết xuất từ hoa hướng dương mà bộ phận chính cho dầu là các hạt hướng dương. Dầu hướng dương có chứa nhiều protein và hàm lượng vitamin E. Dầu hướng dương chứa acid stearic (18%), acid oleic (70%).(Anushree et al. 2017)

1.1.3 Thành phần hóa học trong dầu thực vật

Thành phần hóa học của dầu thực vật chủ yếu là este của acid lipid với glycerine do vậy chúng có đầy đủ tính chất của một este.Một trong những thành phần khác của dầu thực vật là các acid lipid. Phần lớn các acid lipid trong dầu thực vật ở trạng thái kết hợp trong triglyceride và một phần nhỏ ở trạng thái tự do. Nếu thủy phân triglyceride, thu được acid lipid và glycerine. Lượng acid lipid thu được chiếm khoảng 95% so với trọng lượng dầu ban đầu. Glycerine cũng có trong dầu thực vật nhưng rất ít. Glycerine có thể thu được khi thủy phân triglyceride, và là một sản phẩm phụ rất có giá trị.

Phản ứng xà phòng hoá: Trong môi trường kiềm, este trong dầu thực vật với kiềm tạo thành muối natri của acid béo và glyxerin. Quá trình xà phòng hóa cũng xảy ra theo từng giai đoạn trong quá trình thủy phân, cho ta nhiều sản phẩm khác nhau nhưng sản phẩm cuối cùng là xà phòng và glyxerin. Đây là phản ứng cơ bản trong quá trình sản xuất xà phòng và glyxerin từ dầu thực vật.
Phản ứng oxi hoá: Các liên kết đôi trong gốc acid của dầu rất dễ bị oxy hóa. Tùy thuộc vào môi trường và chất oxy hóa mà tạo ra các peroxide hay đứt mạch tạo thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn. Quá trình oxy hóa có thể xảy ra khi dầu thực vật tiếp xúc trực tiếp với không khí làm giẩm đi chất lượng của dầu.
Phản ứng cộng hợp: dầu thực vật có thể tác dụng với halogen ở những liên kết no trong gốc acid. Quá trình no hóa dầu thực vật thường làm tăng độ nhớt và làm đặc dầu thực vật.
Sự ôi chua của dầu mỡ: Do trong dầu có lẫn nước, các vi sinh vật và nấm men, thường xảy ra các biến đổi phân hủy trong quá trình bảo quản sẽ làm ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị.
Phản ứng trao đổi este: Trong môi trường có các chất xúc tác vô cơ như H₂SO₄, HCl, NaOH, KOH, các este trong dầu có thể tiến hành este hóa trao đổi với các rượu bậc 1 như metylic, etylic,… tạo thành các este acid béo với các rượu tương ứng và glycerine.

1.1.4 Lợi ích sức khỏe của dầu thực vật

Trong dầu thực vật có chứa rất nhiều acid béo tốt như omega 3, omega 6 giúp làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn làm tăng hương vị thức ăn và trong dầu thực vật rất giàu vitamin A,D,E,K, không chứa chất béo chuyển hóa giảm nguy cơ đột quỵ.

1.2 TỔNG QUAN VỀ VITAMIN E

1.2.1 Giới thiệu về Vitamin E

Vitamin E, với thành phần chính là a-tocopherol, là một trong những chất chống oxy hóa tốt do sự cản trở phản ứng xấu của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể, có tác dụng ngăn cản quá trình oxy hóa các thành thiết yếu trong tế bào, bảo vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do giúp cơ thể khỏe mạnh (Azzi 2007).

Vitamin E là một trong các loại vitamin không tan trong nước, dễ hòa tan trong dầu, chất béo và các dung môi mỡ (ether, aceton, chlorofom, methanol), vitamin E chủ yếu có nguồn gốc từ thiên nhiên.

Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và 4 tocotrienol trong đó α-tocopherol là hoạt chất sinh học mạnh nhất. Trong thực phẩm, các nguồn phổ biến nhất chứa vitamin E là các loại dầu thực vật như dầu gấc, cọ dầu, hướng dương, ngô, đậu tương, ô liu, hạt ngủ cốc, cá béo, gan, trứng, chất béo của sửa, bơ, lạc, các loại rau lá xanh, … (Abu-Fayyad et al. 2015).

1.2.2 Cấu trúc và tính chất hóa lý của vitamin E

Vitamin E là một chất có nguồn gốc thực vật, hòa tan trong lipid có cấu trúc phân tử bao gồm một vòng chromanol với một chuỗi bên nằm ở vị trí C2. Vitamin E đề cập đến một nhóm gồm tám hợp chất khác nhau: α-, β-, γ-, và δ-tocopherol và bốn tocotrienols tương ứng. Bốn tocopherol có chuỗi bên phytyl bão hòa, trong khi tocotrienols có chuỗi bên isoprenyl không bão hòa chứa ba liên kết đôi ở C3 ′, C7 ′ và C11 ′. Các liên kết đôi của chuỗi bên tocotrienols ở C3 ′ và C7 ′ có một trans-cấu hình. Các dạng α-, β-, γ- và δ khác nhau về số lượng và vị trí của nhóm metyl trên vòng chromanol. Các dạng α của tocopherol và tocotrienol có ba nhóm metyl ở các vị trí C5, C7 và C8 của vòng chromanol, trong khi dạng β- và γ có hai và dạng δ có một nhóm metyl được trình bày trong hình 2.2 (Niki and Abe 2019).

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của các chất đồng đẳng vitamin E

(Nguồn: https://pubs.rsc.org/image/chapter/bk9781788012409/bk9781788012409-00001/bk9781788012409-00001-f1_hi-res.gif)

Vitamin E là một loại dầu hơi nhớt màu vàng, gần như không mùi, trong suốt, có màu sẫm khi tiếp xúc với không khí hoặc ánh sáng do quá trình oxy hóa. (Lucarini and Pedulli 2010)

Vitamin E dễ bị oxy hóa khi ở điều kiện nhiệt, ánh sáng và kiềm, nhưng các este ít bị oxy hóa hơn và do đó thích hợp hơn cho các ứng dụng thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm so với dạng tự do. Các liên hợp polyethylene glycol của tocopherol và tocotrienols có khả năng tạo thành các mixen có thể trộn lẫn trong nước do đặc tính amphiphilic và tăng cường sinh khả dụng ở động vật và con người thông qua việc cải thiện khả năng hòa tan và hấp thụ trong nước của chúng (Abu-Fayyad et al. 2015) .

Bảng 2.2 Tính chất hóa lý của vitamin E

Tính chất Tên IUPAC	Đặc điểm (2 R ) -2,5,7,8-Tetrametyl-2 – [(4 R , 8 R ) -4,8,12-trimethyltridecyl] -3,4-dihydrochromen-6-ol
Công thức phân tử	C ₂₉ H ₅₀ O ₂
Trọng lượng phân tử	430,7 g mol ⁻¹
Mô tả vật lý	Màu hơi vàng , gần như không mùi, trong suốt, nhớt
Độ nóng chảy	3°C
Điểm sôi	235°C
Độ hòa tan	Không hòa tan trong nước (1,9 × 10 ⁻⁶ mg L ⁻¹ ở 25°C), hòa tan trong etanol
Tỉ trọng	0,950 g cm ⁻³ ở 25°C
Hệ số phân tán	log P = 12,2
Sự ổn định	Không bền với tia UV, kiềm và oxy hóa
Hằng số phân ly	p K _a = 10,8
Hấp thụ tia cực tím tối đa	292 nm trong etanol
Huỳnh quang	Kích thích 290–295 nm, phát xạ 320–335 nm
BDE (O – H)	77,1 kcal mol ⁻¹

1.2.3 Chức năng và ứng dụng

Vitamin E được cho là đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng cường sức khỏe và phòng ngừa hoặc điều trị một số bệnh và rối loạn.

Vai trò của vitamin E như một chất chống oxy hóa chống lại quá trình peroxy hóa lipid qua trung gian gốc tự do đã được chứng minh một cách rõ ràng và dường như đây là chức năng sinh lý quan trọng nhất của loại vitamin này.

Vitamin E được sử dụng rộng rãi như một chất bổ sung chế độ ăn uống, tự nó hoặc cùng với các vi chất dinh dưỡng khác như vitamin C, để tăng cường sức khỏe và giảm nguy cơ hoặc ngăn ngừa các bệnh được cho là phát sinh do quá trình thay đổi oxy hóa bất lợi của các phân tử sinh học. Vitamin E được sử dụng để tăng cường cho một số loại thực phẩm và đồ uống.

1.2.4 Tính ổn định

Vitamin E ổn định ở nhiệt độ thường, nhưng nó dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ cao, dưới ánh sáng hoặc trong môi trường kiềm. Chiên là một trong những phương pháp chế biến thực phẩm phổ biến nhất. Trong quá trình chiên nhiệt độ thường dao động từ 160–190 °C. α-Tocopherol bị oxy hóa thành gốc α-tocopheroxyl bởi các ion kim loại chuyển tiếp như ferric ions (Fe ³⁺) và cupric ions (Cu ²⁺).

1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV-VIS)

1.3.1 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) là một trong những kỹ thuật phân tích phổ biến và thuần thục nhất và cho đến nay là kỹ thuật tách được sử dụng rộng rãi nhất. HPLC đã được sử dụng trong các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới trong hơn 40 năm qua cho khoa học dược phẩm, hóa học lâm sàng, phân tích thực phẩm và môi trường, hóa học tổng hợp.

HPLC đã trở nên phổ biến chủ yếu do độ tin cậy của nó (sử dụng hỗ trợ chất lỏng điều khiển bằng áp suất) và tính linh hoạt (khả năng điều chỉnh thành phần của cả pha động và pha tĩnh).

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết của pha tĩnh sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
Sắc ký phân bố (partition chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).
Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực,

Nguyên tắc hoạt động của HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

1.3.1.1 Các bộ phận chính của HPLC

Hình 2.3.1 Sơ đồ cấu tạo HPLC

Nguồn: (https://vstytw2.com.vn/upload/detail/2021/02/images/1(6).jpg)

Bình chứa dung môi: thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. Tất cả hóa chất sử dụng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và phải lọc qua màng lọc 0.22 µm mục đích là tránh làm hỏng cột sắc kí hay nhiều đường nền.

Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, để nhằm loại bỏ các hiện tượng không mong muốn như:

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi.
Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.

Bơm cao áp: mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo áp suất cao khoảng 250-500 atm (1 atm = 0.98 bar) và phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10 mL/ phút¹.

Bộ phận tiêm mẫu: Mục đích để tiêm mẫu vào cột phân tích với dung tích của loop là 5-100 µL. Có 2 cách để đưa mẫu vào cột: bằng tiêm thủ công hoặc tiêm tự động.

Cột sắc ký: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm. Cột sắc ký thường chứa đầy một pha đứng yên và điều kiện phân tích phù hợp nhất chính là nhiệt độ của pha động và cột sắc ký được giữ không đổi trong suốt quá trình phân tích.

Đầu dò: bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp. Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, UV-VIS, huỳnh quang, khối phổ, tán xạ bay hơi.

Bộ ghi nhận tín hiệu: do đầu dò phát hiện, với các hệ thống hiện đại phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, tính toán và xử lý thông số có liên quan đến kết quả phân tích.

2.3.1.3 Ứng dụng.

Hệ thống HPLC dùng để phân tích:

Phân tích dư lượng thuốc kháng sinh
Phân tích các chất gây ô nhiễm thực phẩm
Phân tích phụ gia thực phẩm
Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu
Phân tích chất lượng nước uống.

1.3.2 TỔNG QUAN ĐẦU DÒ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV-VIS)

1.3.2.1 Giới thiệu

Phổ hấp thụ UV-VIS là đám phổ (băng phổ) có các cực đại và cực tiểu của phổ nằm ở các bước sóng xác định tùy thuộc vào cấu trúc và các liên kết trong phân tử hay nhóm nguyên tử.

Đầu dò này thường được sử dụng trong hóa học phân tích phân tích định tính trong sắc ký khí chỉ cần pic không bị biến dạng nhiều nhằm xác định chính xác đỉnh pic, còn trong phân tích định lượng thì yêu cầu đạt cao hơn như độ lặp lại, độ so sánh, độ chính xác . Để đáp ứng được các yêu cầuđó, cần phải đảm bảo sự ổn định đủ lớn các thông số detector: dòngđiện nuôimạch cầu, nhiệt độ trong detector, tỷ lệ giữ khí đốt và khí mang cũng như thế phân cực khi dùng detector FID.

Các bộ phận chính của UV-VIS

Hình 2. 3. Sơ đồ cấu tạo máy đầu dò hấp thụ UV-VIS

Nguồn:(https://www.vinaquips.com/uploads/tai-lieu/2020_04/uv-vis-faq-instrument-design-spectrophotometer-function.png)

Máy quang phổ UV-VIS về cơ bản được cấu tạo từ các thành phần sau :

Nguồn sáng : có nhiệm vụ cung cấp bức xạ tương thích với quá trình đo, thường là chùm bức xạ đa sắc.
Bộ phận đơn sắc hóa : gồm có kính lọc, lăng kính, cách tử, khe sáng.
Buồng đo : khoang hấp thu quang phổ là vùng tối, nằm nơi cuối cùng của đường truyền, khi tia bức xạ đơn sắc được phân tách sẽ đi đến đó.
Detector : bộ phận đảm nhận vai trò ghi nhận và xử lý tín hiệu quang thành tín hiệu điện. Bộ phận này có tác dụng cảm nhận bức xạ điện từ sau khi bị hấp thụ và chuyển dúng thành dòng điện.

1.3.2.2 Ứng dụng của UV-VIS

Xác định hàm Fe trong mẫu thực phẩm như nước, các mẫu bột mì…
Hàm lượng nitrit, nitrat trong mẫu thịt.
Hàm lượng photpho…
Kiểm soát chất lượng đồ uống công nghiệp…

1.4 QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHÂN TÍCH

1.4.1 Nguyên tắc thực hiện

Chuẩn vitamin E và mẫu được xà phòng hóa để chuyển vitamin E ở dạng All-rac-a-Tocopheryl acetate (tên gọi khác là dl-alpha tocopheryl acetate) về All-rac-a-tocopherol (tên gọi khác là dl-alpha Tocopherol) và chiết tách khỏi mẫu bằng dung môi thích hợp. Định lượng Vitamin E thu được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV ở bước sóng 292nm.

1.4.2 Hóa chất và thuốc thử

1.4.2.1 Hóa chất

All-rac-a-Tocopheryl acetate có giấy chứng nhận
Methanol (HPLC) (Merck , Germany)
Deionized water (HPLC) (T.Baker-US)
Etanol (95%, Acros, US)
Sodium sulphate anhydrous (Na₂SO₄ anhydrate) (99%, Merck, Germany)
KOH (85% Merck, US)
Pyrogalol (98%, Merck, Germany).
Acid ascorbic (AA) (99%, Merck, Germany)
Hexane (97%, Merck, Germany)
Diethyl ether (≥99.7%, France)
Petroleum ether (dầu nhẹ có dải nhiệt độ sôi từ 40^oC đến 60oC)
Mixture diethyl ether – petroleum ether = 20:80, v/v

1.4.2.2 Thuốc thử

Dung dịch chuẩn gốc 5000 mg/L:
Cân 0.5 g vitamin E (All – rac – a – Tocopheryl acetate), chính xác đến 0.1 mg, vào bình định mức 100 mL, thêm khoảng 0.5 g pyrogalol (hoặc 0.5g acid ascorbic + 20 mL ethanol + 5 mL KOH 50%. Lắc đều, xà phòng hóa 15 – 45 phút, nhiệt độ từ 80 – 100 ^oC trên bếp cách thủy. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 5 mL acid acetic, lắc. Định mức đến vạch bằng acetonitril.
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản trong bình kín ở điều kiện nhiệt độ (-20 ^oC), sử dụng trong 2 tuần.
Dung dịch KOH 50%:
Cho từ từ 500 g vào cốc 2 L có chứa sẵn 500 mL nước cất, khuấy đề cho đến tan hoàn toàn (lưu ý: quá trình hòa tan tỏa nhiệt cao, thao tác cẩn thận và thực hiện trong tủ hút).
Dung dịch chuẩn làm việc 5 (200 mg L^–¹):
Rút 1ml dung dịch chuẩn 5000 mg L^–1cho vào bình định mức 25 ml định mức bằng ACN .
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản nhiệt độ phòng và sử dụng trong ngày.
Dung dịch chuẩn làm việc 4 (50 mg L^–1):
Rút 0.5ml dung dịch chuẩn 5000 mg L^–1cho vào bình định mức 50ml định mức bằng ACN.
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản trong bình kín điều kiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong ngày.
Dung dịch chuẩn làm việc 3 (5 mg L^–1):
Rút 1.25ml dung dịch chuẩn làm việc 5 cho vào bình định mức 10ml định mức bằng ACN.
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản trong bình kín điều kiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong ngày.
Dung dịch chuẩn làm việc 2 (10 mg L^–1):
Rút 0.5 ml dung dịch chuẩn làm việc 5 cho vào bình định mức 10 ml định mức bằng ACN.
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản trong hủ kín điều kiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong ngày.
Dung dịch chuẩn làm việc 1 (2.5 mg L^–1):
Rút 2.5 ml dung dịch chuẩn làm việc 4 cho vào bình định mức 10 ml định mức bằng ACN.
Dung dịch sau khi pha xong được bảo quản trong bình kín điều kiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong ngày.

1.4.3 Thiết bị và dụng cụ

1.4.3.1 Thiết bị

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Thermo Scientific)
Đầu dò UV (Labomed, Inc)
Cột C18 (Hamilton, Switzerland)
Cân phân tích, chính xác đến ±1 mg. (Ohaus, USA)
Bể siêu âm (Bandelin Sonorex Super RK 1028 CH, Germany)
Xi lanh tiêm mẫu HPLC (Hamilton – USA)

1.4.3.2 Dụng cụ

Giấy lọc
Micropipette các loại: 10-100 mL, 100-1000 mL, 500-5000 mL (Hirschmann, Germany)
Đầu típ nhựa 10-100 mL, 100-1000 mL, 500-5000 mL
Pipette Pasteur (Hirschmann, Germany)
Bình định mức dung tích 100mL (Isolab, Germany
Bình cầu 250mL (Isolab, Germany)
Bình chiết 500mL (MBL, England)
Các dụng cụ thử nghiệm thông thường khác

1.4.4 Chuẩn bị mẫu

1.4.4.1 Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu phải được đồng nhất, xay mịn bằng máy xay (đối với mẫu rắn)
Đối với mẫu lỏng có gas, tiến hành đuổi khí CO₂ bằng cách cho mẫu ra cốc dùng máy khuấy để đuổi CO₂ (hoặc siêu âm mẫu) đến khi hết khí trước khi tiến hành hút mẫu.
Đối với mẫu dễ hư hỏng phải bảo quản lạnh và tránh ánh sáng.
Cân 5 – 10 g mẫu vào bình cầu 250 mL.

1.4.4.2 Chuẩn bị mẫu dựng đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc được tóm tắt ở bảng sau:

Bảng 2.4. Dung dịch chuẩn làm việc

STT chuẩn	Chuẩn 1	Chuẩn 2	Chuẩn 3	Chuẩn 4	Chuẩn 5
Nồng độ chuẩn làm việc (mg/L)	2,5	10,0	25,0	50,0	200,0
Vrút dd chuẩn 5000 mg/L (mL)	–	–	–	–	1,0
Vrút dd chuẩn 5000 mg/L (mL)	–	–	–	0,5	–
Vrút dd chuẩn 5 (200mg/L) (mL)	–	–	1,25	–	–
Vrút dd chuẩn 5 (200mg/L) (mL)	–	0,5	–	–	–
Vrút dd chuẩn 4 (50mg/L) (mL)	0,5	–	–	–	–
Thể tích định mức cuối cùng (mL)	10,0	10,0	10,0	50,0	25,0
Dung môi định mức	ACN

1.4.5 Quy trình thực hiện

Sau đây là quy trình thực hiện được thể hiện ở Hình 2.7:

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình phân tích hàm lượng vitamin e

1.4.6 Thuyết minh quy trình phân tích

1.4.6.1 Xà phòng hóa mẫu

Cân khoảng 5-10 g mẫu vào bình cầu 250 mL. Thêm khoảng 0.5 g pyrogalol + 50 mL ethanol + 20 mL KOH 50%. Lắc đều, xà phòng hóa 15 – 45 phút, nhiệt độ dao động từ 80 – 100 ^oC trên bếp cách thủy. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.

1.4.6.2 Chiết mẫu

Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi xà phòng và được làm nguội đến nhiệt độ phòng vào bình lóng 500 mL, dùng ethanol tráng và lấy hết mẫu trong bình cầu.

Thêm khoảng 80 mL dung môi chiết dietyl ete vào bình lóng, lắc, để yên đến khi dung dịch tách lớp. Nếu dung dịch bị nhũ không tách lớp, thêm một ít ethanol, lắc nhẹ.

Sau đó chuyển lớp dung dịch phía dưới vào bình lóng thứ 2, tiếp tục thêm khoảng 80 mL hỗn hợp dietyl ete – ete dầu (20:80) vào bình lóng thứ 2 và chiết tương tự

Xả bỏ lớp dung dịch bên dưới, gộp chung dịch chiết vào bình lóng thứ nhất, rửa nhanh dịch chiết với nước cho đến khi hết kiềm (dùng giấy pH để thử lớp nước rửa cho đến khi pH về trung tính).

Cho dịch chiết qua giấy lọc có chứa lớp natri sulfat khan và hứng vào bình cầu chứa dung tích 250 mL, cô quay dung dịch đến khô. Hòa tan trở lại bằng 5 mL methanol

Lọc qua giấy lọc 0,45 µm cho vào vial và tiến hành phân tích trên HPLC-UV.

2.4.6.3 Phân tích trên thiết bị HPLC-UV

Điều kiện phân tích: